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關(guān)于PCR,你知道多少?(一)

更新時間:2025-10-13點擊次數(shù):39

PCR的原理

多聚酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction)簡稱PCR技術(shù),是近30多年發(fā)展起來的一種體外擴增特異性DNA片段的技術(shù),可在數(shù)小時之內(nèi)對僅有幾個拷貝的基因放大千萬倍。那么,PCR的原理是怎樣的呢?

PCR技術(shù)實際上是在模板DNA、引物以及原料(四種脫氧核糖核苷酸)在適宜的反應(yīng)條件下,通過DNA聚合酶的酶促反應(yīng)完成DNA擴增的過程。

PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。PCR反應(yīng)分為三步:

1)變性:通過加熱時DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離成單鏈DNA;

2)退火:當溫度突然降低時由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物復(fù)雜的多,而且反應(yīng)體系中引物DNA量遠大于模板DNA,使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈,而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少;

3)延伸:在DNA聚合酶和四種脫氧核糖核苷酸第五以及Mg2+存在的條件下,5’→3’的聚合酶催化以引物為起點的DNA鏈延伸反應(yīng)。

4)3步為一個循環(huán),每一個循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板,30個循環(huán)左右,介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量的復(fù)制,數(shù)量可達2×107個拷貝。

    如圖中所示,經(jīng)過高溫變性,低溫退火和中溫延伸3個溫度的作用,模板上介于兩個引物之間的片段不斷得到擴增。每循環(huán)一次,目的基因的拷貝數(shù)加倍,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,目的基因以2n的形式增長。PCR擴增的特異性是由人工合成的一對引物來決定的。在反應(yīng)的最初階段,原來的DNA起著起始模板的作用,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,由引物介導(dǎo)的片段急劇增多而成為主要的模板。


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