活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也稱ROS Assay Kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。
 

　　使用說明：
 

　　1. 裝載探針
 

　　對于刺激時間較短(通常為2小時以內(nèi))的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。
 

　　原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細胞。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。通常活性氧陽性對照在刺激細胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
 

　　收集細胞后裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后刺激細胞。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
 

　　說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。
 

　　2. 檢測
 

　　對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。
 

　　3. 參數(shù)設(shè)置
 

　　使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。
 

　　4. 其它說明
 

　　陽性對照可以按照1:1000的比例使用。例如裝載好探針的細胞共1毫升，可以加入1微升的陽性對照刺激。通常刺激后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當降低活性氧陽性對照的濃度。
 

　　另外，對于某些細胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000-1:5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA的濃度為2-5微摩爾/升。
 

　　探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當進行調(diào)整。
 

　　活性氧陽性對照(Rosup)僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。